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       近年來,質粒等可移動元件介導的耐藥基因水平傳播所致革蘭陰性菌耐藥性的快速發展,引起全球高度關注。



劉健華教授:首次揭示質粒編碼的可介導替加環素耐藥的新型多重耐藥外排泵

近期,華南農業大學國家獸醫微生物耐藥性風險評估實驗室在微生物學國際主流學術期刊mBio在線發表了關于肺炎克雷伯菌質粒上發現的一種新型可介導替加環素等藥物耐藥的多重耐藥外排泵基因簇(tmexCD1-toprJ1)的研究論文,該研究系統性地闡述了tmexCD1-toprJ1耐藥基因簇的功能、起源以及流行情況…… 詳細全文




近期,華南農業大學國家獸醫微生物耐藥性風險評估實驗室在微生物學國際主流學術期刊mBio在線發表了關于肺炎克雷伯菌質粒上發現的一種新型可介導替加環素等藥物耐藥的多重耐藥外排泵基因簇(tmexCD1-toprJ1)的研究論文,該研究系統性地闡述了tmexCD1-toprJ1耐藥基因簇的功能、起源以及流行情況。

近年來,質粒等可移動元件介導的耐藥基因水平傳播所致革蘭陰性菌耐藥性的快速發展,引起全球高度關注。黏菌素和替加環素是治療多重耐藥革蘭氏陰性桿菌感染的少數有效藥物,然而,質粒介導黏菌素耐藥基因mcr-1的出現及其在全球的廣泛傳播,導致黏菌素的臨床應用價值面臨挑戰,使替加環素成為治療多重耐藥腸桿菌所致嚴重感染的有限藥物之一。目前,除了染色體上RND型外排泵過表達以及質粒編碼的Tet(A)外排泵變異體和替加環素修飾酶Tet(X3)、Tet(X4)和Tet(X5)介導的替加環素耐藥機制外,尚未發現可水平轉移的RND型外排泵與替加環素耐藥性相關的報道。

2017年,課題組分離到雞源泛耐藥肺炎克雷伯菌,同時對替加環素耐藥,通過全基因組測序,發現細菌同時攜帶碳青霉烯耐藥基因(blaNDM-1)、黏菌素耐藥基因(mcr-1、mcr-8)等30個耐藥基因,未檢測到已知的替加環素耐藥機制,但發現攜帶一個質粒編碼的RND型外排泵基因簇,該基因簇與銅綠假單胞菌染色體上的mexCD-oprJ基因簇有78%的核苷酸序列同源性,同時位于質粒上具有可轉移能力,將其命名為tmexCD1-toprJ1(t表示transferable),并推測該基因簇可能與替加環素耐藥有關。通過克隆和接合實驗,確證tmexCD1-toprJ1可介導肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和沙門氏菌對甘氨酰環素類(替加環素)、四環素類、喹諾酮類、頭孢菌素類和氨基糖苷類等多種藥物耐藥(MIC值增加4~32倍),這意味著tmexCD1-toprJ1也是一種新的質粒介導的喹諾酮耐藥基因(PMQR)。

為了證實TMexCD1-TOprJ1的外排泵功能,課題組進一步通過細菌藥物蓄積實驗,發現攜帶有外排泵的宿主菌的藥物蓄積濃度明顯低于對照菌株,并對外排泵抑制劑N-甲基吡咯烷酮(NMP)表現出更為顯著的反應。此外,小鼠感染模型的替加環素治療實驗結果顯示,接種tmexCD1-toprJ1陽性肺炎克雷伯菌的小鼠死亡率更高,提示其可能會導致臨床治療失敗。


圖1TMexCD1-TOprJ1對替加環素體內體外活性研究

本研究進一步分析了tmexCD1-toprJ1的基因環境和質粒結構,發現tmexCD1-toprJ1位于可接合的IncFIA型質粒(pHNAH8I-1)上,同時該質粒上還攜帶黏菌素耐藥基因(mcr-8)。之后通過分析這種新型外排泵基因簇的基因環境,發現在外排泵上游存在位點特異性整合酶基因,與tnfxB1-tmexC1-tmexD1-toprJ1基因簇一同插入在轉座子Tn5393的轉座酶tnpA基因中。在Genbank數據庫中搜索相應高相似度的序列進行比對分析后,推測外排泵基因簇可能通過假定整合酶,從染色體捕獲上并轉移到質粒上傳播。之后,課題組通過構建遺傳進化樹方法,發現假單胞菌染色體上存在同源性最為接近的外排泵基因簇,因此推定tmexCD1-toprJ1可能來源于某種假單胞菌染色體。


圖2 pHNAH8I-1質粒結構和tmexCD1-toprJ1基因環境比較圖


圖3 TMexD1及相關高同源性蛋白遺傳進化樹

課題組隨后進行流行病學調查,發現tmexCD1-toprJ1主要在國內多個地區養雞場中廣泛傳播,并已擴散至動物性食品和人,主要在肺炎克雷伯菌及其相近菌屬中流行。盡管tmexCD1-toprJ1在人源腸桿菌中檢出率較低,但考慮到tmexCD1-toprJ1的可轉移性和外排泵底物的廣泛性,tmexCD1-toprJ1可能會進一步傳播,對食品安全和人類健康構成潛在威脅。


圖4攜帶tmexCD1-toprJ1陽性菌株流行分布情況

本研究首次報道了一種新型的質粒介導的多重耐藥RND家族外排泵,此外排泵可導致包括替加環素在內的多種臨床常用藥物耐藥。因此,應加強相應的流行病學監測,以控制攜帶TMexCD1-TOprJ1外排泵菌株的進一步傳播。

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作者簡介:

劉健華,女,1973年10月出生于江西省宜春市,農學博士,教授,博士生導師。

國家杰出青年基金獲得者,廣東省特支計劃“百千萬工程領軍人才”,廣東省“千百十工程”省級培養對象,全國獸藥殘留與耐藥性控制專家委員會委員,國家獸醫微生物耐藥性風險評估實驗室副主任。

2001年在中國農業大學獲得臨床獸醫學博士學位,此后在華南農業大學從事博士后研究,2003年7月出站后留校任教并受聘副教授,2013年晉升為教授。

長期從事細菌耐藥性和獸藥安全評價研究,在動物源腸桿菌對多粘菌素類、磷霉素類、氟喹諾酮類、β-內酰胺類和氨基糖苷類藥物等的耐藥性產生和傳播機制方面開展了系列研究工作,在國際上首次發現了質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1。相關研究成果以第一作者或通訊作者發表SCI收錄論文39篇,影響因子累計超過200,累計被引用1800多次,單篇最高他引600多次,H指數21,其中有兩篇論文入選為ESI高被引論文,兩篇被F1000Prime 推薦和點評。

曾獲教育部高等學校科學研究優秀成果獎(科學技術)科技進步一等獎1項和廣東省科技進步二等獎1項,并獲得首屆盛彤笙獸醫科學獎--杰出青年學者獎。

先后指導和協助指導多名研究生進行耐藥性方面的研究,其中有3人獲廣東省優秀碩士論文獎、14人獲校優秀碩士論文獎、1人獲校優秀博士論文獎、1人獲得廣東省“南粵優秀研究生”稱號和2人獲“廣東省優秀研究生”稱號。協助指導的1名博士研究生獲全國百篇優秀博士論文提名獎、1人獲廣東省優秀博士論文獎。



 

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