打破限制,CRISPR標記方法實現將任何功能編程到任何細胞類型中

【字體: 時間:2020年12月02日 來源:生物通

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  “DNA編輯已廣泛用于改變基因序列,但在基因被關閉的情況下無濟于事。”

  

杜克大學的生物醫學工程師團隊創造了一種新方法,可以通過掌握基因調控網絡的語言將干細胞轉變為所需的細胞類型。

這一成果公布在Cell Reports雜志上,這種方法可以制造成熟的成年神經元,可用于編程任何細胞類型。

將干細胞編程為其他細胞類型并不是一個新概念,之前科學家們已經研發了幾種方法,但是結果還有一些不足之處。在實驗室中培養時,程序化的干細胞通常無法正確成熟,因此尋找成年神經元細胞進行實驗的研究人員可能最終會得到胚胎神經元,而胚胎神經元無法模擬遲發性精神病和神經退行性疾病。

杜克大學博士Josh Black說:“乍一看,這些細胞似乎是正確的。但它們經常缺少您想要的細胞一些關鍵特性。”

CRISPR技術最常用于編輯DNA序列,稱為“基因組編輯剪刀”,其中Cas9蛋白與導向RNA結合,引導Cas9在特定位置切割DNA,從而導致DNA序列發生變化。“DNA編輯已廣泛用于改變基因序列,但在基因被關閉的情況下無濟于事。”

失活的Cas9(dCas9)蛋白將附著在DNA上而不切割。實際上,如果沒有其他分子附著或吸收它,它通常不會做任何事情。這一研究組之前已經報道了將不同分子結構域連接到dCas9蛋白的多種方法,這些方法將告訴細胞打開基因并重塑染色質結構。

在2016年,Black和Gersbach報道了一種使用基于CRISPR的基因激活來開啟基因網絡的方法,該基因網絡會將成纖維細胞(一種易于接觸的組成結締組織的細胞類型)轉化為神經元細胞。這項研究針對的是已知與神經元規格有關的基因網絡,但并未產生具有建立有效疾病模型所需的所有特性的細胞。但是,產生這些所需細胞的正確基因網絡尚不清楚,并且人類基因組中編碼了成千上萬種可能性。因此,Black和Gersbach設計了一種策略,可以在一個實驗中測試所有網絡。

他們從多能干細胞開始,因為這種細胞類型應該能夠變成人體內的任何其他細胞。為了利用干細胞制造成熟的神經元,該團隊設計了一旦成為神經元的干細胞就會發出紅色熒光。熒光越亮,對神經元命運的推動越強。然后,他們建立了一個匯集了數千個導向RNA的文庫,這些RNA靶向人類基因組中編碼轉錄因子的所有基因。轉錄因子是基因網絡的主要調節因子,因此要生成所需的神經元,必須將所有正確的轉錄因子都打開。

他們將CRISPR基因激活劑和導向RNA庫引入干細胞,以便每個細胞僅接受單個導向RNA,打開了其特定的相應轉錄因子基因靶標。然后,他們根據它們變成紅色的方式對細胞進行分類,并在最多和最少的紅細胞中對RNA進行測序,找到哪些基因打開后會使細胞或多或少地具有神經元的功能。

研究人員分析了由導向RNA改造的干細胞的基因表達,結果表明相應的細胞產生了更特異性和更成熟的神經元類型。他們還發現了同時靶向時共同起作用的基因。此外,實驗揭示了拮抗干細胞神經元功能的因素。

但是,這些結果都只是在測量神經元標記。要知道這些工程細胞是否確實能重現更多成熟神經元的功能,就需要測試其傳輸電信號的能力。

為此,他們求助于Scott Soderling教授,Soderling實驗室的研究生Shataakshi Dube使用一種稱為膜片鉗電生理的技術來測量新形成的神經元內部的電信號。“我對這些干細胞如何變成神經元感到好奇,但也對此表示懷疑,不過,看到這些程序化細胞看起來像正常神經元的程度令人驚訝。”

從干細胞到成熟神經元細胞的過程耗時7天,與其他耗時數周或數月的方法相比,大大縮短了時間。更快的時間表可能會極大地加快神經疾病新療法的開發和測試。

Gersbach說:“這項工作的關鍵是開發利用基于CRISPR的DNA靶向能力和可擴展性的方法,將任何功能編程到任何細胞類型中。” “通過利用已經在我們的基因組中編碼的基因網絡,我們對細胞生物學的控制得到了極大的改善。”

(生物通)

原文標題:

Master Regulators and Cofactors of Human Neuronal Cell Fate Specification Identified by CRISPR Gene Activation Screens


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